Biologia cellulare e biochimica del sistema vascolare e respiratorio

1) Biochimica delle piastrine - Responsabile: Prof. Mauro Torti, Prof. Gianni Guidetti, Prof. Ilaria Canobbio

Gruppo di ricerca: Mauro Torti (professore ordinario)Ilaria Canobbio (ricercatore), Gianni Guidetti (ricercatore), Caterina Visconte (dottoranda), Marta Zarà (dottoranda), Jessica Canino (dottoranda).

Nel nostro laboratorio vengono studiati gli eventi biochimici coinvolti nell’attivazione delle piastrine al fine di chiarirne i meccanismi di controllo. Le piastrine svolgono un ruolo cruciale nell’emostasi, nella trombosi e in numerosi fenomeni fisiopatologici, tra cui i processi infiammatori, le malattie neurodegenerative e la metastasi dei tumori. Lo studio del coinvolgimento delle piastrine in questi eventi rappresenta una promettente area di ricerca in grado di aprire nuovi scenari in ambito biomedico.

1) Studio dei meccanismi di trasduzione del segnale nelle piastrine nel contesto dell’emostasi e della trombosi

La conoscenza approfondita dei meccanismi di trasduzione del segnale che mediano l’attivazione piastrinica è essenziale per identificare nuovi bersagli farmacologici per le patologie trombotiche, le quali rappresentano la principale causa di mortalità ed invalidità nei Paesi industrializzati. In questo contesto, il nostro gruppo di ricerca si occupa di investigare i seguenti aspetti fondamentali:

  • ruolo delle tirosin chinasi (Src, Syk, Pyk2, FAK) e dei processi di fosforilazione in tirosina nell’adesione, attivazione ed aggregazione piastrinica
  • contributo delle diverse isoforme dell’enzima fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) nell’attivazione piastrinica e caratterizzazione della regolazione di questi enzimi
  • processi di trasduzione del segnale innescati dall'adesione piastrinica mediata da integrine, recettori accoppiati a proteine G e recettori contenenti domini ITAM
  • meccanismi dell’attivazione piastrinica indotta da nanoparticelle di origine ambientale o sviluppate per applicazioni industriali e biomediche.

2) Analisi del metabolismo e della funzione della proteina precursore di amiloide (APP) nelle piastrine: una connessione tra emostasi, trombosi e malattia di Alzheimer.

La malattia di Alzheimer è correlata all’accumulo di peptidi amiloidi nel cervello e nei vasi cerebrali. I peptidi amiloidi derivano dal metabolismo della proteina precursore di amiloide (APP). Le piastrine esprimono APP e, quando attivate, rilasciano nel plasma peptidi amiloidi. Nel nostro laboratorio ci occupiamo di:

  • studiare l’effetto dell’accumulo dei peptidi amiloidi nella circolazione periferica. Abbiamo dimostrato che i peptidi amiloidi sono in grado di attivare le piastrine e di promuovere uno stato di infiammazione cronica. In collaborazione con il prof. Pula, dell’Università di Bath (UK) ci stiamo ora occupando di definire l’effetto dei peptidi sull’attivazione delle cellule del sistema immunitario, in particolare neutrofili, e sulle cellule endoteliali
  • definire il ruolo dei peptidi amiloidi derivati dalle piastrine nell’insorgenza e nella progressione della malattia. Per fare questo utilizziamo modelli murini transgenici che producono elevate quantità di peptidi amiloidi (topi 3xTgAD) e valutiamo i livelli di attivazione piastrinica e infiammazione nella circolazione periferica, e la capacità dei peptidi rilasciati dalle piastrine di attraversare la barriera ematoencefalica e depositarsi nel cervello
  • studiare il ruolo della proteina precursore di amiloide APP nella fisiopatologia delle piastrine e nell’emostasi. Utilizzando topi che non esprimono APP (APPKO) abbiamo definito un ruolo chiave per APP come recettore adesivo e nella regolazione dell’emostasi.

3) Studio del ruolo delle piastrine e delle microparticelle rilasciate dalle piastrine nella metastasi

La metastasi è fortemente influenzata dalle interazioni che possono avere luogo tra le cellule tumorali e l’organismo ospite. In questo contesto è stato dimostrato che le piastrine sono componenti essenziali del processo metastatico e che la loro deplezione, in pazienti trombocitopenici o in modelli animali, limita la diffusione del tumore. Questo suggerisce che anche il controllo farmacologico dell’attivazione delle piastrine possa rappresentare un’arma terapeutica per bloccare o contenere la diffusione metastatica.

L’obiettivo del nostro studio è la comprensione degli aspetti molecolari alla base del contributo delle piastrine nella metastasi. In particolare, la nostra attenzione è focalizzata sul ruolo delle microparticelle rilasciate dalle piastrine (platelet-derived microparticles, PMPs). Le PMPs sono vescicole rilasciate dalla piastrine in seguito ad attivazione e rappresentano importanti trasportatori di segnali biologici in grado di modulare l’attività di cellule bersaglio. Con questa linea di ricerca ci proponiamo di:

  • analizzare la capacità della PMPs di alterare il potenziale metastatico delle cellule tumorali
  • studiare i meccanismi molecolari alla base dell’attività prometastatica delle PMPs
  • effettuare un’analisi comparativa dell’effetto di diversi trattamenti farmacologici sull’attività prometastatica delle piastrine e delle PMPs
  • valutare gli effetti prometastatici delle PMPs in vivo in modelli animali.

Principali collaborazioni del gruppo di ricerca

  • Mitsuhiko Okigaki (Department of Cardiovascular Medicine,Kyoto Prefectural University of Medicine, Kyoto, Japan)
  • Emilio Hirsch (MBC, Università di Torino)
  • Maria Enrica Tira (Dipartimento di Biologia e Biotecnologie, Università degli Studi di Pavia)
  • Giampaolo Minetti (Dipartimento di Biologia e Biotecnologie, Università degli Studi di Pavia)
  • Carlo Balduini, Patrizia Noris, Alessandro Pecci (IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia)
  • Giordano Pula (Department of Pharmacy and Pharmacology, University of Bath, UK)
  • Luciaanna Stivala, Ornella Cazzalini, Paola Perucca (Dipartimento di Medicina Molecolare, Università degli Studi di Pavia)
  • Satya P. Kunapuli (Departments of Physiology and Pharmacology and Sol Sherry Thrombosis Research Center, Temple University, School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania)
  • Maries Van den Broek (Institute of Experimental Immunology, University of Zurich, Switzerland)

 Principali tecniche e metodiche utilizzate dal gruppo di ricerca

Purificazione e analisi di cellule del sangue (piastrine e neutrofili). Isolamento e caratterizzazione di microparticelle e microvescicole piastriniche. Metodi biochimici per l’analisi delle proteine (elettroforesi, western blotting, analisi in chemiluminescenza, spettrofotometria, spettrofluorimetria, citofluorimetria). Saggi di adesione cellulare in condizioni statiche e di flusso. Microscopia ottica (contrasto di fase e fluorescenza). Tecniche di biologia molecolare, estrazione DNA e RNA,PCR

Purificazione di proteine (espressione in ospiti batterici, cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità, gel filtrazione, HPLC, FPLC). Manipolazione di colture cellulari, mantenimento, trasfezione, analisi di migrazione, proliferazione, rilascio di metalloproteasi. Utilizzo di modelli animali (Mus musculus) geneticamente modificati (Pyk2-KO, PI3Kb-KD, APPKO, 3xTgAD, PLCg2-KO).

2) Biochimica del globulo rosso - Responsabile: Prof. Giampaolo Minetti

Collaboratori: Dr Cesare Achilli, Post-doc; Dr Annarita Ciana, Post-Doc; Anjali Gaur, Dottoranda del progetto  RELEVANCE, Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Networks, Horizon 2020.

Biochimica dei globuli rossi

La linea di ricerca principale del gruppo verte sullo studio delle membrane biologiche con particolare riferimento al modello classico di membrana cellulare, quella dell'eritrocita umano. L’interesse è nello studio delle proprietà biochimiche degli eritrociti normali, patologici, invecchiati in vivo e di quelli conservati a fini trasfusionali. Inoltre sono studiati gli eritrociti prodotti in condizioni estreme (alpinismo, microgravità) destinati ad essere eliminati secondo il meccanismo della cosiddetta neocitolisi. Quali metodi di analisi biochimici e biofisici delle componenti proteiche e lipidiche della membrana eritrocitaria sono utilizzati l'elettroforesi, il western blotting la microscopia in fluorescenza, la risonanza paramagnetica elettronica e analoghi di acidi grassi e "click chemistry" per lo studio dell'acilazione delle proteine di membrana. L'attività ha lo scopo di meglio caratterizzare la struttura e la funzione dei diversi domini di membrana, quali il membranoscheletro, i "raft" di membrana, le vescicole di membrana e le loro interazioni. Una tecnica di separazione ad alta risoluzione è impiegata in laboratorio per la separazione e la caratterizzazione di eritrociti umani di diversa età cellulare.

Metionina solfossido reduttasi

Un altro ambito di ricerca coltivato nel laboratorio è quello degli enzimi Metionina solfossido reduttasi (Msr). L'ossidazione dei residui di metionina nelle proteine spesso risulta nella perdita di attività biologica della proteina interessata. Gli enzimi Msr sono importanti sistemi di riparo di questo danno, perché riducono la metionina solfossido a metionina. La ricerca è originata dall’osservazione che l'attività Msr di neutrofili umani è principalmente efficace verso uno dei due diastereoisomeri della L-Metionina solfossido. Il sospetto che due diverse classi di enzimi Msr con opposta stereospecificità possa esistere in natura è stato confermato da molteplici studi nella letteratura successiva. Nel corso di quello studio abbiamo sviluppato e proposto un metodo di analisi dell'attività Msr che è stato adottato in seguito da molti gruppi di ricerca. I neutrofili sono cellule del sistema immunitario innato che fagocitano patogeni invasori e li neutralizzano utilizzando specie reattive dell'ossigeno (ROS). I ROS possono indurre auto-ossidazione delle strutture stesse del neutrofilo. Le Msr sono espresse a livelli elevati nei neutrofili, probabilmente perché rappresentano un efficace sistema di protezione o di riparo del danno ossidativo delle metionine, in particolare l'isoforma MsrB1 che è uno dei pochi selenoenzimi espressi nell'uomo e che è attivamente studiata in questa linea di ricerca.

Le cellule del sangue nello studio tossicologico dei nanomateriali

Una nuova linea di ricerca riguarda l'utilizzo di cellule del sangue come strumenti d’indagine delle proprietà tossicologiche delle nanoparticelle.

3) Proteomica/metabolomica nello studio di malattie gravi di origine differente - Responsabile: Prof. Paolo Iadarola

Vedi punto 4 della tematica di ricerca "Basi molecolari delle patologie umane"