Biologia molecolare, Citogenetica, Epigenomica

Responsabili
Elena Giulotto: Biologia Molecolare e Cellulare
Elena Raimondi: Citogenetica Molecolare
Solomon Nergadze: Epigenomica e Bioinformatica

Collaboratori
Mirella Bensi (tecnico), Eleonora Cappelletti (dottoranda), Marco Corbo (dottorando), Riccardo Gamba (dottorando), Francesco Gozzo (dottorando), Lela Khoriauli (assegnista), Francesca Piras (assegnista), Annalisa Roberti (dottoranda), Marco Santagostino (assegnista)

Metodi di studio
Le competenze complementari dei docenti responsabili consentono di affrontare le problematiche scientifiche descritte attraverso diversi approcci sperimentali fra cui un ampio spettro di metodiche cellulari, biomolecolari (comprese tecniche di Next Generation sequencing), citogenetiche (compresa l’analisi di singole molecole di cromatina) e bioinformatiche.

Linee di ricerca
I progetti di ricerca riguardano i meccanismi molecolari coinvolti nel mantenimento dell’integrità del genoma dei mammiferi che svolgono un ruolo fondamentale nella cancerogenesi e nell’evoluzione. Le principali strutture necessarie per il mantenimento dell’integrità strutturale e funzionale dei cromosomi sono i centromeri ed i telomeri.

1) Il centromero e la sua natura epigenetica

I centromeri sono essenziali per la separazione dei cromosomi durante la divisione cellulare. Sono strutture enigmatiche perché, al contrario di quanto avviene per altri loci genetici, la funzione dei centromeri non è determinata dalla sequenza di DNA, ma da fattori epigenetici. In particolare, la cromatina centromerica è peculiare per la presenza dell’istone H3 modificato, CENP-A, e di numerose proteine che costituiscono il complesso denominato CCAN (Constitutive Centromere Associated Network). Inoltre, la centrocromatina è caratterizzata da modificazioni istoniche, il cui ruolo nella funzione del centromero è controverso.

I centromeri dei mammiferi sono tipicamente associati a DNA altamente ripetuto (DNA satellite); questo tipo di organizzazione ha ostacolato l’analisi molecolare dettagliata della cromatina centromerica.

Il sistema modello degli equidi
Il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato per la prima volta l’esistenza in natura di centromeri privi di DNA ripetuto stabili e funzionali (Wade et al Science 2009). Questi centromeri sono presenti in numerosi cromosomi del genere Equus (cavalli, asini e zebre); essi costituiscono un sistema modello innovativo per lo studio del controllo epigenetico della funzione centromerica e del suo ruolo nell’evoluzione dei cariotipi (Piras et al PLoS Genetics 2010; Purgato et al Chromosoma 2015).
E’ noto che alterazioni della segregazione cromosomica sono responsabili dell’ insorgenza di anomalie del numero cromosomico osservate nella maggior parte dei tumori.
Il sistema Equidi offre pertanto l’opportunità di investigare i meccanismi coinvolti nell’instabilità cromosomica associata allo sviluppo e progressione di molte forme di cancro.
L’assenza di DNA ripetuto al centromero di molti cromosomi equini ci offre la possibilità di studiare l’architettura della cromatina centromerica e, in particolare, del ruolo della metilazione del DNA, della trascrizione e delle modificazioni istoniche.

Collaborazioni: Kevin Sullivan (University of Galway, Ireland), Aurora Ruiz-Herrera (Universitat Autonoma de Barcelona, Spain), Giulio Pavesi (Università di Milano), Mariano Rocchi (Università di Bari), Doug Antczak (Cornell University, Ithaca New York), The Horse Genome Project, The Horse FAANG Project.

2) Il telomero e la sua trascrizione

I telomeri sono strutture nucleoproteiche localizzate alle estremità dei cromosomi lineari. Nei mammiferi il DNA telomerico, costituito dalla ripetizione in tandem dell’esanucleotide TTAGGG, è legato da un complesso multiproteico denominato “shelterin”. I telomeri proteggono la terminazione dei cromosomi dalla degradazione e dalla fusione con altri telomeri. Il malfunzionamento dei telomeri causa riarrangiamenti cromosomici che possono portare alla tumorigenesi. Telomeri troppo corti sono indistinguibili da rotture accidentali del DNA e causano instabilità genomica. Il nostro gruppo ha contribuito alla dimostrazione che i telomeri sono trascritti in molecole di RNA non codificante chiamate TElomeric Repeat-containing RNA (TERRA) (Azzalin et al. Science 2007). Abbiamo poi dimostrato che la trascrizione dei telomeri è finemente regolata (Nergadze et al. RNA 2009) ed è probabilmente coinvolta nel mantenimento dell’integrità dei telomeri.

Trascritti telomerici nei tumori
E' stato dimostrato che la deregolazione della trascrizione dell’RNA telomerico è deleteria per il metabolismo dei telomeri e porta a instabilità genomica. Difetti nella regolazione dell’espressione dell’RNA telomerico potrebbero pertanto contribuire alla cancerogenesi e alla progressione tumorale. Il nostro gruppo si propone di studiare lo stato trascrizionale dei telomeri in cellule normali e tumorali. L'analisi dell'espressione dei telomeri in tessuti ottenuti da pazienti affetti da diversi tipi di tumore ci permetterà di studiare il legame tra la deregolazione della trascrizione dell'RNA telomerico, la cancerogenesi e la progressione tumorale.

Telomeri interstiziali
I telomeri interstiziali sono sequenze costituite da ripetizioni telomeriche localizzate a siti interni dei cromosomi. I nostri lavori hanno dimostrato che, nei mammiferi, i telomeri interstiziali sono stati inseriti nel corso dell’evoluzione durante la riparazione di rotture a doppio filamento ad opera della telomerasi o attraverso la cattura di molecole di DNA telomerico a doppio filamento (Nergadze et al Genome Res. 2004; Nergadze et al Genome Biol. 2007). Abbiamo recentemente dimostrato che alcuni telomeri interstiziali svolgono un ruolo nella regolazione dell'espressione genica. Il nostro gruppo si propone di analizzare l'evoluzione e la funzione dei telomeri interstiziali utilizzando metodiche molecolari, citogenetiche e bioinformatiche.

Instabilità telomerica indotta da radiazioni ionizzanti
Le radiazioni ionizzanti causano gravi lesioni alla doppia elica di DNA, dovute alla formazione di radicali liberi e a stress ossidativo. E' noto che i telomeri sono particolarmente suscettibili ai danni indotti dalle radiazioni ionizzanti che provocano un'accelerazione del loro accorciamento.
Il nostro gruppo di ricerca si propone di identificare i fattori coinvolti nel metabolismo telomerico con particolare attenzione alla regolazione della trascrizione in risposta ai danni causati dall’esposizione a radiazioni ionizzanti.

Collaborazioni: Claus Azzalin (ETH Zurich, Switzerland), Camillo Porta (IRCCS San Matteo, Pavia), Giovanni Barosi e Vittorio Rosti (IRCCS San Matteo, Pavia), Aurora Ruiz-Herrera (Universitat Autonoma de Barcelona, Spain), Andrea Ottolenghi (Università di Pavia)

3) Produzione di proteine ricombinanti in cellule umane

La produzione di proteine umane ricombinanti è estremamente rilevante in diversi campi applicativi (produzione di farmaci, diagnostica) e di ricerca (studi biochimici e strutturali).  Proteine ricombinanti possono essere prodotte impiegando sistemi di espressione procariotici o eucariotici. I sistemi di espressione procariotici vengono comunemente usati per la produzione su larga scala di alcuni farmaci di natura proteica, come l’insulina. Altre molecole, come per esempio l'eritropoietina, richiedono invece modificazioni post-traduzionali che possono avvenire correttamente solo in cellule di mammifero.
Abbiamo sviluppato un sistema vettore-cellula ospite che consente un’elevata efficienza produttiva rispetto ai sistemi di cellule di mammifero tradizionalmente impiegati. Con questo sistema siamo in grado di ottenere centinaia di copie di geni esogeni in linee cellulari umane con conseguente iperespressione della proteina codificata. Il sistema consente di aumentare l’efficienza produttiva rispetto ai sistemi tradizionali diminuendo quindi i costi di produzione. L’adozione di un sistema di produzione in cellule umane apre nuove prospettive per migliorare l’efficacia terapeutica dei farmaci proteici destinati all’uomo e diminuirne gli effetti collaterali. Sono in corso progetti per la costruzione di linee cellulari umane produttive di specifiche proteine di interesse farmacologico e diagnostico.

Collaborazioni: Mark Pepys (University College London), Federico Forneris (Università di Pavia), Vittorio Bellotti e Sofia Giorgetti (Università di Pavia)