Genetica, genomica e biotecnologie microbiche

Responsabili: Prof. Cinzia Calvio, Prof. Davide Sassera, Prof. Claudio Seppi

Collaboratori: Giulia Barbieri (assegnista), Paolo Gabrieli (assegnista), Luca Longanesi (assegnista), Elisabetta Andreoli (tecnico), Giuliano Gasperi (professore a contratto), Francesco Comandatore (assegnista), Stefano Gaiarsa (dottorando), Leone De Marco (dottorando), Emanuela Clementi (tecnico), Luciano Sacchi (professore a contratto)

Linee di ricerca

Cariplo LogoMIGLIORAMENTO DELLA PRODUZIONE DI gamma-PGA IN Bacillus subtilis - C. Calvio, C. Seppi; in collaborazione con P. Mustarelli del Dip. di Chimica e P. Magni Dip. di Ingegneria Industriale e dell'Informazione (Universita' di Pavia) e con G. Mazzini (IGM-CNR, Pavia)

La spinta verso l’utilizzo di materie prime sicure, ottenute da fonti rinnovabili, è alla base dell’interesse sempre maggiore per i biopolimeri naturali. Il γ-PGA è un polimero prodotto da batteri principalmente del genere Bacillus, anionico, formato da migliaia di residui di acido glutammico, che grazie alla sua assoluta non tossicità, l’idrosolubilità e la biodegradabilità, trova applicazione in numerosi campi bioetcologici: come flocculante nella rimozione di metalli pesanti nel trattamento di liquidi reflui, come crioprotettivo, umettante e addensante nell’industria cosmetica ed alimentare, come colla biologica, carrier di farmaci e vaccini e come materiale di supporto per la rigenerazione tissutale nell’industria biomedica. Per il suo pieno sfruttamento industriale occorre innanzitutto ridurre drasticamente i costi di produzione, aumentando la produttività batterica e migliorando le condizioni di fermentazione. Nel nostro laboratorio è stato ottenuto un ceppo produttore derivato dal ceppo di laboratorio ampiamente caratterizzato di B. subtilis 168 (Osera et al., 2009). La disponibilità di un ceppo ben noto, sul quale è possibile applicare tecniche di ingegneria genetica, offre la possibilità di applicare strategie di miglioramento genetico e di razionalizzazione delle condizioni di coltura basate sulla genetica e fisiologia dell’organismo. Introducendo alcune mutazioni nei pathway metabolici della biosintesi del polimero, abbiamo ottenuto ceppi che accumulano questo prodotto in maniera elevata e costante (Scoffone et al. 2013). Ora la sfida è “spingere” il ceppo produttore ad usare come nutrimento scarti  organici di settori agroindustriali.

Per abbattere i costi di produzione del γ-PGA il nostro obiettivo è utilizzare sia una biomassa a disponibilità illimitata come la paglia di riso, attualmente sotto utilizzata, che il glicerolo grezzo, co-prodotto durante la sintesi del biodiesel. Il successo di questo progetto avrà quindi effetti positivi non solo sulla produzione del γ-PGA ma contribuirà alla valorizzazione economica della filiera del riso e della produzione del biodiesel e concorrerà all’espansione della bio-economia. Questa linea di ricerca ed è attualmente sostenuta da due linee di finanziamento della FONDAZIONE CARIPLO.

IDROLASI gamma-PGA-SPECIFICHE COME AGENTI ANTIBATTERICI - C. Calvio, C. Seppi; in collaborazione con C. Morelli del Dip. di Chimica (Universita' Statale di Milano), A. Pastore del Dip. di Medicina Molecolare (Universita' di Pavia).

Sono stati identificati e caratterizzati quattro nuovi geni in B. subtilis che codificano per γ-PGA idrolasi. E’ stato scoperto che questi geni, di origine fagica, si sono diffusi in numerose specie batteriche attraverso trasferimento genico orizzontale (Mamberti et al., 2015). Abbiamo inoltre identificato i geni per la biosintesi del PGA in numerose altre specie di microorganismi, tra cui alcuni patogeni, e stiamo ora analizzando il ruolo del polimero come fattore di virulenza in alcune di queste specie e il possibile utilizzo delle γ-PGA idrolasi come agenti antibatterici.

RUOLO BIOLOGICO DI SwrA, PROTEINA REGOLATRICE DI Bacillus subtilis A FUNZIONE SCONOSCIUTA - C. Calvio

In Bacillus subtilis il sistema a due componenti DegS-DegU è un regolatore centrale che controlla l'espressione di più di cento geni coinvolti nella transizione dalla fase di crescita esponenziale a quella stazionaria, coordina il differenziamento delle singole cellule nelle comunità multicellulari e, in batteri patogeni come Listeria monocytogenes o Bacillus anthracis, è coinvolto nella virulenza. E’ stato osservato che il livello di fosforilazione di DegU regola in maniera complessa la motilità di B. subtilis. Anche SwrA, che non appartiene ad alcune classe proteica nota, è coinvolta nella regolazione della mobilità. Abbiamo dimostrato, utilizzando sia dati genetici in vivo, mediante la costruzione di mutanti e l’analisi dell’espressione di geni bersaglio di DegU, sia informazioni molecolari, attraverso la produzione delle proteine in forma ricombinante da utilizzare per saggi in vitro, che l’interazione funzionale tra DegU ed SwrA è conseguenza di un’interazione molecolare tra le due proteine (Mordini et al., 2013). Stiamo ora analizzando l’effetto di SwrA su altri pathways genetici controllati da DegU ed altre peculiarità molecolari che sembrano caratterizzare il locus swrA.

EPIDEMIOLOGIA GENOMICA E GENOMICA COMPARATIVA DI PATOGENI NOSOCOMIALI - D.Sassera; in collaborazione con P. Marone (IRCCS Policlinico S. Matteo di Pavia), S. Brisse (Institut Pasteur, Parigi), E. Feil (University of Bath)

Questa linea di ricerca è incentrata sul sequenziamento whole-genome di numeri elevati di ceppi di batteri patogeni nosocomiali. I genomi così generati vengono analizzati con strumenti bioinformatici, anche sviluppati ad hoc, per l'analisi genomica comparativa e di epidemiologia genomica. L'analisi genomica di patogeni nosocomiali permette di valutare la variabilità genomica, individuare la presenza e la mobilità degli elementi di virulenza e di resistenza agli antibiotici, descrivere eventi di ricombinazione e in generale di variazioni dell'architettura genomica. Questo approccio porta a ricadute applicative, quali la possibilità di ricostruire eventi epidemici e di individuare pattern di trasmissione, di caratterizzare ceppi di interesse in base alla resistenza e virulenza, e di avvicinarsi all'obbiettivo della diagnostica genomica in microbiologia.

RUOLO DELLA SIMBIOSI IN PARASSITI - D.Sassera; in collaborazione con C. Bandi (Universita' degli Studi di Milano), B. Makepeace (University of Liverpool), O. Plantard (INRA, Nantes), G. Favia e I. Ricci (Universita' di Camerino)

Microorganismi simbionti sono diffusi in molti organismi, ove assumono i ruoli più disparati, dal parassitismo al mutualismo obbligato. Nell'ambito di questa linea di ricerca, utilizziamo un approccio fortemente interdisciplinare per individuare nuove simbiosi e comprendere il ruolo dei simbionti nella biologia degli ospiti. Integrando metodiche di microscopia ottica ed elettronica, di biologia molecolare, di genomica e di trascrittomica stiamo attualmente lavorando su diversi microorganismi:

Midichloria mitochondrii: batterio dell'ordine Rickettsiales, simbionte della zecca Ixodes ricinus, presenta la caratteristica unica di localizzarsi all'interno dei mitocondri delle cellule ospiti. Stiamo attualmente lavorando per comprendere il ruolo del batterio nella fisiologia della zecca, attraverso un approccio integrato di microscopia elettronica, trascrittomica e proteomica. In parallelo stiamo ricercando batteri filogeneticamente vicini a M. mitochondrii in altri ospiti con tecniche di genomica.

Lieviti simbionti: ceppi di lieviti possono avere un ruolo di simbionti in diverse specie di artropodi, anche vettori di importanti patologie. Con un progetto multidisciplinare che combina microscopia elettronica e genomica comparativa stiamo investigando la presenza e il ruolo di lieviti delle specie Wickeramomyces anomalus e Meyerozyma guilliermondii  in zanzare e flebotomi.

TRASCRITTOMICA DI ARTROPODI VETTORI - D. Sassera; in collaborazione con S. Epis (Universita' degli Studi di Milano), S. Urbanelli e D. Porretta (Universita' di Roma La Sapienza), G. Favia e I. Ricci (Universita' di Camerino)

L'utilizzo della metodica RNA-seq permette la valutazione delle variazioni di espressione genica a livello di intero trascrittoma. In questa linea di ricerca si investigano tali variazioni in artropodi vettori di patologie di grande interesse medico, zanzare e zecche, in risposta a stimoli specifici, quali la presenza di molecole insetticide, o nel corso del ciclo vitale. L'obiettivo è comprendere aspetti fondamentali della biologia di questi vettori, e specifiche risposte a trattamenti, per il disegno di strategie innovative di controllo.