Genetica, genomica e biotecnologie microbiche

Responsabili: Prof. Alessandra Albertini, Prof. Cinzia Calvio, Prof. Davide Sassera, Prof. Claudio Seppi

Collaboratori: Giulia Barbieri (assegnista), Paolo Gabrieli (assegnista), Luca Longanesi (assegnista), Elisabetta Andreoli (tecnico), Giuliano Gasperi (professore a contratto), Francesco Comandatore (assegnista), Stefano Gaiarsa (dottorando), Leone De Marco (dottorando), Emanuela Clementi (tecnico), Luciano Sacchi (professore a contratto)

Linee di ricerca

1) REGOLAZIONE DELL'ESPRESSIONE GENICA NELL'ORGANISMO MODELLO Bacillus subtilis - A. Albertini; in collaborazione con A.L. Sonenshein e B.R. Belitsky del Department of Molecular Biology and Microbiology, Tufts University of Boston MA, USA

Tra gli interessi dell’attività di ricerca del gruppo rientra lo studio della regolazione dell’espressione genica in Bacillus subtilis. Quando si trovano a crescere in ambienti poveri, o in seguito all’esaurimento dei nutrienti nel terreno di crescita, i batteri sono in grado di mettere in atto diverse strategie per sopravvivere. Queste includono lo sviluppo della capacità di muoversi, la sintesi di enzimi degradativi e di trasportatori in grado di importare i prodotti di degradazione, la produzione di antibiotici. Bacillus subtilis è inoltre in grado di andare incontro a particolari processi differenziativi come lo sviluppo di competenza (la capacità di acquisire DNA dall’ambiente esterno), ed il differenziamento in una forma metabolicamente dormiente ed altamente resistente agli stress: la spora. Il nostro gruppo è interessato allo studio dei processi di regolazione dell’espressione genica che sono attivati all’inizio della fase di crescita stazionaria e che sono quindi alla base di queste diverse risposte differenziative. In particolare, in collaborazione con i professori A.L. Sonenshein e B. Belitsky della  Tufts University di Boston, abbiamo recentemente dimostrato come il fattore trascrizionale CodY, uno dei principali regolatori della risposta allo stress nutrizionale, sia coinvolto nella regolazione dell’espressione di quattro proteasi extracellulari di B. subtilis.

Pubblicazioni sul tema

  1. Barbieri G, Albertini AM, Ferrari E, Sonenshein AL, Belitsky BR. Interplay of CodY and ScoC in the Regulation of Major Extracellular Protease Genes of Bacillus subtilis. J Bacteriol. Jan 4;198(6):907-20. doi: 10.1128/JB.00894-15, 2016
  2. Belitsky BR, Barbieri G, Albertini AM, Ferrari E, Strauch MA, Sonenshein AL. Interactive regulation by the Bacillus subtilis global regulators CodY and ScoC. Mol Microbiol., Aug;97(4):698-716. doi: 10.1111/mmi.13056 4.419, 2015
  3. Barbieri G, Voigt B, Albrecht D, Hecker M, Albertini AM, Sonenshein AL, Ferrari E, Belitsky BR. CodY regulates expression of the Bacillus subtilis extracellular proteases Vpr and Mpr. J Bacteriol. Apr;197(8):1423-32. doi: 10.1128/JB.02588-14. 2.808, 2015
2) IDENTIFICAZIONE DI NUOVI INSETTICIDI BIOLOGICI DA BATTERI PER IL CONTROLLO DI AEDES ALBOPICTUS (ZANZARA TIGRE) - A. Albertini, G. Gasperi

Il progetto, finanziato dalla Fondazione Bussolera Branca, coinvolge il Laboratorio di Genetica e Biotecnologie Microbiche e quello di Genomica e Biotecnologie di insetti di importanza agraria e sanitaria   del Dip.to di Biologia e Biotecnologie dell’Univ. di Pavia, grazie alle competenze complementari con cui si cerca di identificare nuovi ceppi batterici in grado di produrre molecole ad attività insetticida per il controllo specifico di Aedes albopictus. Per tale scopo, vengono ricercati in natura (suolo, acqua stagnante, etc.) batteri con attività larvicida validata su un ceppo standard di zanzara tigre di origine italiana, disponibile in laboratorio. Successivamente, i ceppi batterici e i composti ad attività bioinsetticida da essi isolati verranno saggiati su popolazioni naturali di Aedes albopictus per una loro validazione in funzione di una possibile utilizzazione in campo, oltre che per la loro non tossicità nei confronti di vertebrati, altri insetti e specie animali e vegetali di interesse agronomico.

Sono impiegati approcci genomici e metagenomici per identificare i geni coinvolti nella produzione dei bioinsetticidi; clonaggio ed approcci di “genome shuffling” saranno messi a punto per caratterizzare e migliorare il livello di espressione dei nuovi insetticidi nel batterio più idoneo alla produzione su scala commerciale di questi metaboliti, quale il B. subtilis.

3) CLONAGGIO ED IPERESPRESSIONE DI NUOVI CATALIZZATORI ENZIMATICI - A. Albertini; in collaborazione con D. Ubiali e T. Bavaro del Dipartimento di Scienze del Farmaco (Universita' di Pavia) e G. Speranza e C. Morelli del Dipartimento di Chimica (Universita' Statale di Milano)

La conoscenza del corredo genico e quindi enzimatico di di oltre un migliaio di specie batteriche, per le quali è stato determinata la sequenza dell'intero genoma, consente di accedere ad una collezione naturale di attivita` enzimatiche utile nel campo delle biotecnologie farmaceutiche. In particolare ci siamo interessati al clonaggio di geni per acilasi, enzimi impiegati per la reazione inversa di semi-sintesi di antibiotici Beta-lattamici, da diverse fonti microbiche (Gram+ e Gram-). Inoltre sono state studiate le caratteristiche di enzimi derivati da clonaggio ed iperespressione in E. coli, dei geni di Bacillus e Lactobacillus coinvolti nella modificazione di basi, puriniche e pirimidiniche e dei nucleosidi di-e tri-fosfati, quali purine e pirimidine fosforilasi, ribonucleotide reduttasi. Scopo di questi progetti è la produzione di nuovi catalizzatori immobilizzabili attraverso la ricerca di nuovi enzimi provenienti da diverse fonti procariotiche, e l’accoppiamento di strategie di mutagenesi sito specifica ed immobilizzazione per la progettazione razionale di biocatalizzatori più efficienti.

Recentemente, in collaborazione con C. Morelli (Dipartimento di Chimica, Università Statale di Milano), grazie ad un finanziamento di ricerca CARIPLO si stanno conducendo studi sulle reazioni di trans-peptidazione catalizzate da g-glutamil trans-peptidasi (GGT) di origine microbica per migliorare, attraverso la mutagenesi, le proprietà catalitiche di questi enzimi così da produrre nuovi derivati g-glutamilici di interesse nell'industria alimentare e farmaceutica. La mutagenesi e la selezione di GGT ricombinanti permetteranno l'immobilizzazione per lo sviluppo di processi in grande scala.

Pubblicazioni sul tema

  1. Biagiotti M, Borghese G, Francescato P, Morelli C F, Albertini AM, Bavaro T, Ubiali D, Mendichi R and Speranza G. Esterification of poly(γ-glutamic acid) (γ-PGA) mediated by its tetrabutylammonium salt. RSC Adv., 6, 43954-43958. doi: 10.1039/C6RA08567A, 2016
  2. Ubiali D., Morelli C.F., Rabuffetti M., Cattaneo G., Serra I., Bavaro T., Albertini A.M. and Speranza G. Substrate Specificity of a Purine Nucleoside Phosphorylase from Aeromonas hydrophila Toward 6-Substituted Purines and its Use as a Biocatalyst in the Synthesis of the Corresponding Ribonucleosides, Curr. Org. Chem. 19 (22): 2220 – 2225,. 2.157, 2015
  3. Serra I., Ubiali D., Cecchini D.A., Calleri E., Albertini A.M., Terreni M., Temporini C. Assessment of immobilized PGA orientation via the LC-MS analysis of tryptic digests of the wild type and its 3K-PGA mutant assists in the rational design of a high-performance biocatalyst. Anal Bioanal Chem. Jan; 405(2-3):745-53. doi: 10.1007/s00216-012-6143-z , 2013
  4. Serra I., Bavaro T., Cecchini D. A., Daly S., Albertini A.M., Terreni M., Ubiali D., A Comparison between Immobilized Pyrimidine Nucleoside Phosphorylase from Bacillus subtilis and Thymidine Phosphorylase from Escherichia coli in the Synthesis of 5-Substituted Pyrimidine 2′-Deoxyribonucleosides. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 95, 16-22, DOI information: 10.1016/j.molcatb.2013.05.007, 2013
  5. Serra I., Ubiali D., Piskur J., Christoffersen S., Lewkowicz E., Iribarren A. M.,. Albertini A. M, Terreni M., Developing a Collection of Immobilized Nucleoside Phosphorylases for the preparation of Nucleoside Analogues: Enzymatic Synthesis of Arabinosyladenine and 2',3'-Dideoxyinosine, Chem Plus Chem, 78 (2), 157-165. DOI: 10.1002/cplu.201200278, 2013
  6. Serra I., Ubiali D., Cecchini D.A., Calleri E., Albertini A.M., Terreni M., Temporini C. Assessment of immobilized PGA orientation via the LC-MS analysis of tryptic digests of the wild type and its 3K-PGA mutant assists in the rational design of a high-performance biocatalyst. Anal Bioanal Chem., 405(2-3):745-53, DOI: 10.1007/s00216-012-6143-z, 2012
  7. Ubiali D., Serra C.D., Serra I., Morelli C.F., Terreni M., Albertini A.M., Manitto P. and Speranza G. Production, characterization and synthetic applicatio of a purine nucleoside phosphorylase from Aereomonas hydrophyla. Adv Synth. Catal. 354, 96-1041, 2012
  8. Serra I, Cecchini DA, Ubiali D, Manazza EM, Albertini AM, Terreni M. Coupling of site-directed mutagenesis and immobilization for the rational design of more efficient biocatalysts. The case of immobilized 3G3K PGA from coli. Eur. J. Org. Chem., 9:1384 -1389, 2009
  9. Cecchini DA, Serra I, Ubiali D, Terreni M and Albertini AM. New active site oriented glyoxyl-agarose derivatives of Escherichia coli penicillin G acylase. BMC Biotechnol.7: 54, 2007.
Cariplo Logo4) MIGLIORAMENTO DELLA PRODUZIONE DI gamma-PGA IN Bacillus subtilis - C. Calvio, C. Seppi; in collaborazione con P. Mustarelli del Dip. di Chimica e P. Magni Dip. di Ingegneria Industriale e dell'Informazione (Universita' di Pavia) e con G. Mazzini (IGM-CNR, Pavia)

La spinta verso l’utilizzo di materie prime sicure, ottenute da fonti rinnovabili, è alla base dell’interesse sempre maggiore per i biopolimeri naturali. Il γ-PGA è un polimero prodotto da batteri principalmente del genere Bacillus, anionico, formato da migliaia di residui di acido glutammico, che grazie alla sua assoluta non tossicità, l’idrosolubilità e la biodegradabilità, trova applicazione in numerosi campi bioetcologici: come flocculante nella rimozione di metalli pesanti nel trattamento di liquidi reflui, come crioprotettivo, umettante e addensante nell’industria cosmetica ed alimentare, come colla biologica, carrier di farmaci e vaccini e come materiale di supporto per la rigenerazione tissutale nell’industria biomedica. Per il suo pieno sfruttamento industriale occorre innanzitutto ridurre drasticamente i costi di produzione, aumentando la produttività batterica e migliorando le condizioni di fermentazione. Nel nostro laboratorio è stato ottenuto un ceppo produttore derivato dal ceppo di laboratorio ampiamente caratterizzato di B. subtilis 168 (Osera et al., 2009). La disponibilità di un ceppo ben noto, sul quale è possibile applicare tecniche di ingegneria genetica, offre la possibilità di applicare strategie di miglioramento genetico e di razionalizzazione delle condizioni di coltura basate sulla genetica e fisiologia dell’organismo. Introducendo alcune mutazioni nei pathway metabolici della biosintesi del polimero, abbiamo ottenuto ceppi che accumulano questo prodotto in maniera elevata e costante (Scoffone et al. 2013). Ora la sfida è “spingere” il ceppo produttore ad usare come nutrimento scarti  organici di settori agroindustriali.

Per abbattere i costi di produzione del γ-PGA il nostro obiettivo è utilizzare sia una biomassa a disponibilità illimitata come la paglia di riso, attualmente sotto utilizzata, che il glicerolo grezzo, co-prodotto durante la sintesi del biodiesel. Il successo di questo progetto avrà quindi effetti positivi non solo sulla produzione del γ-PGA ma contribuirà alla valorizzazione economica della filiera del riso e della produzione del biodiesel e concorrerà all’espansione della bio-economia. Questa linea di ricerca ed è attualmente sostenuta da due linee di finanziamento della FONDAZIONE CARIPLO.

5) IDROLASI gamma-PGA-SPECIFICHE COME AGENTI ANTIBATTERICI - C. Calvio, C. Seppi; in collaborazione con C. Morelli del Dip. di Chimica (Universita' Statale di Milano), A. Pastore del Dip. di Medicina Molecolare (Universita' di Pavia).

Sono stati identificati e caratterizzati quattro nuovi geni in B. subtilis che codificano per γ-PGA idrolasi. E’ stato scoperto che questi geni, di origine fagica, si sono diffusi in numerose specie batteriche attraverso trasferimento genico orizzontale (Mamberti et al., 2015). Abbiamo inoltre identificato i geni per la biosintesi del PGA in numerose altre specie di microorganismi, tra cui alcuni patogeni, e stiamo ora analizzando il ruolo del polimero come fattore di virulenza in alcune di queste specie e il possibile utilizzo delle γ-PGA idrolasi come agenti antibatterici.

6) RUOLO BIOLOGICO DI SwrA, PROTEINA REGOLATRICE DI Bacillus subtilis A FUNZIONE SCONOSCIUTA - C. Calvio

In Bacillus subtilis il sistema a due componenti DegS-DegU è un regolatore centrale che controlla l'espressione di più di cento geni coinvolti nella transizione dalla fase di crescita esponenziale a quella stazionaria, coordina il differenziamento delle singole cellule nelle comunità multicellulari e, in batteri patogeni come Listeria monocytogenes o Bacillus anthracis, è coinvolto nella virulenza. E’ stato osservato che il livello di fosforilazione di DegU regola in maniera complessa la motilità di B. subtilis. Anche SwrA, che non appartiene ad alcune classe proteica nota, è coinvolta nella regolazione della mobilità. Abbiamo dimostrato, utilizzando sia dati genetici in vivo, mediante la costruzione di mutanti e l’analisi dell’espressione di geni bersaglio di DegU, sia informazioni molecolari, attraverso la produzione delle proteine in forma ricombinante da utilizzare per saggi in vitro, che l’interazione funzionale tra DegU ed SwrA è conseguenza di un’interazione molecolare tra le due proteine (Mordini et al., 2013). Stiamo ora analizzando l’effetto di SwrA su altri pathways genetici controllati da DegU ed altre peculiarità molecolari che sembrano caratterizzare il locus swrA.

7) EPIDEMIOLOGIA GENOMICA E GENOMICA COMPARATIVA DI PATOGENI NOSOCOMIALI - D.Sassera; in collaborazione con P. Marone (IRCCS Policlinico S. Matteo di Pavia), S. Brisse (Institut Pasteur, Parigi), E. Feil (University of Bath)

Questa linea di ricerca è incentrata sul sequenziamento whole-genome di numeri elevati di ceppi di batteri patogeni nosocomiali. I genomi così generati vengono analizzati con strumenti bioinformatici, anche sviluppati ad hoc, per l'analisi genomica comparativa e di epidemiologia genomica. L'analisi genomica di patogeni nosocomiali permette di valutare la variabilità genomica, individuare la presenza e la mobilità degli elementi di virulenza e di resistenza agli antibiotici, descrivere eventi di ricombinazione e in generale di variazioni dell'architettura genomica. Questo approccio porta a ricadute applicative, quali la possibilità di ricostruire eventi epidemici e di individuare pattern di trasmissione, di caratterizzare ceppi di interesse in base alla resistenza e virulenza, e di avvicinarsi all'obbiettivo della diagnostica genomica in microbiologia.

8) RUOLO DELLA SIMBIOSI IN PARASSITI - D.Sassera; in collaborazione con C. Bandi (Universita' degli Studi di Milano), B. Makepeace (University of Liverpool), O. Plantard (INRA, Nantes), G. Favia e I. Ricci (Universita' di Camerino)

Microorganismi simbionti sono diffusi in molti organismi, ove assumono i ruoli più disparati, dal parassitismo al mutualismo obbligato. Nell'ambito di questa linea di ricerca, utilizziamo un approccio fortemente interdisciplinare per individuare nuove simbiosi e comprendere il ruolo dei simbionti nella biologia degli ospiti. Integrando metodiche di microscopia ottica ed elettronica, di biologia molecolare, di genomica e di trascrittomica stiamo attualmente lavorando su diversi microorganismi:

Midichloria mitochondrii: batterio dell'ordine Rickettsiales, simbionte della zecca Ixodes ricinus, presenta la caratteristica unica di localizzarsi all'interno dei mitocondri delle cellule ospiti. Stiamo attualmente lavorando per comprendere il ruolo del batterio nella fisiologia della zecca, attraverso un approccio integrato di microscopia elettronica, trascrittomica e proteomica. In parallelo stiamo ricercando batteri filogeneticamente vicini a M. mitochondrii in altri ospiti con tecniche di genomica.

Lieviti simbionti: ceppi di lieviti possono avere un ruolo di simbionti in diverse specie di artropodi, anche vettori di importanti patologie. Con un progetto multidisciplinare che combina microscopia elettronica e genomica comparativa stiamo investigando la presenza e il ruolo di lieviti delle specie Wickeramomyces anomalus e Meyerozyma guilliermondii  in zanzare e flebotomi.

9) TRASCRITTOMICA DI ARTROPODI VETTORI - D. Sassera; in collaborazione con S. Epis (Universita' degli Studi di Milano), S. Urbanelli e D. Porretta (Universita' di Roma La Sapienza), G. Favia e I. Ricci (Universita' di Camerino)

L'utilizzo della metodica RNA-seq permette la valutazione delle variazioni di espressione genica a livello di intero trascrittoma. In questa linea di ricerca si investigano tali variazioni in artropodi vettori di patologie di grande interesse medico, zanzare e zecche, in risposta a stimoli specifici, quali la presenza di molecole insetticide, o nel corso del ciclo vitale. L'obiettivo è comprendere aspetti fondamentali della biologia di questi vettori, e specifiche risposte a trattamenti, per il disegno di strategie innovative di controllo.